基于荧光共振能量转移快速检测食品中的四环素(3)

图4 氨基化的NaYF4：Yb，Er UCNPs合成表征Fig.4 The synthesis characterization image of aminofunctionalized NaYF4：Yb，Er UCNPs

作为 FRET 供体和受体，NaYF4：Yb，Er UCNPs和GNPs的形状和大小非常重要。如图1所示，NaYF4：Yb，ErUCNPs的SEM图像显示其分布均匀，直径为60nm～80 nm，符合生物标志物的要求。同时，NaYF4：Yb，Er UCNPs在表面没有亲水性官能团，不具备生物学特性[39]，因此需要对其进行表面修饰。修饰后的NaYF4：Yb，Er UCNPs用X射线衍射（XDR）对其进行表征，如图3所示，氨基化 NaYF4：Yb，Er UCNPs与标准卡片 JCPDS 和JCPDS 一致，且没有明显的杂质峰，同时氨基化修饰后与修饰前相比，上转换纳米材料的结构没有受到影响，修饰后的荧光强度增强。图4给出了UCNPs的表面修饰的红外光谱图（Fourier transform infrared spectroscopy，FT-IR），从 FT-IR 图中可看出，修饰前，在 3 417、2 928、2 873 cm-1处出现了强度不一的吸收峰，其中在3 417 cm-1观察到羟基的伸缩振动特征峰；2 928、2 873cm-1等处出现了属于亚甲基的不对称和对称伸缩振动特征峰。氨基修饰后，出现了一个位于1084cm-1处新的吸收峰，同时伴随2 928、2 873cm-1处的吸收峰消失，这归结于二氧化硅键的对称伸缩振动，说明上转换纳米材料已成功被二氧化硅包覆。而在3 251、1 612 cm-1处均出现了由氨基引起的振动峰，这也证明了所制备的NaYF4：Yb，Er UCNPs氨基化修饰成功。

从图2中可看出，通过柠檬酸钠合成法制备的GNPs，形状近似为球形，尺寸相对均匀，为10 nm。同时，利用柠檬酸钠作为还原剂制备出的GNPs能够很好的分散在水中，形成稳定的胶体溶液[23]。

2.2 NaYF4：Yb，Er UCNPs 连接 TCs Ab 和 GNPs 连接TCs Ag-BSA的表征

图 5为 976 nm 激发光下 NaYF4：Yb，Er UCNPs的荧光光谱图，图6为GNPs偶联TCs Ag-BSA前后的紫外可见吸收光谱图和TCs Ab-UCNPs的荧光发射光谱图。

图5 976 nm激发光下NaYF4：Yb,Er UCNPs的荧光光谱Fig.5 Fluorescence spectra of NaYF4：Yb,Er UCNPs in the 976 nm excitation

如图5所示，在 976 nm激发光下 NaYF4：Yb，Er UCNPs可以得到3组荧光特征发射峰：525、542 nm和660 nm，其中541 nm处的荧光强度最强，呈现出明显的绿色荧光，故将其作为响应光谱，后续平台的构建主要看此处的荧光强度变化。此外，通过对UCNPs和TCs-Ab偶联前后的荧光图进行对比，发现偶联后的波长和形状与偶联前相一致，发射峰的位置没有改变，但位于541 nm处荧光强度有所减弱，说明UCNPs已经成功连接上抗体。

GNPs易于与生物分子结合，本研究证实了TCs Ag-BSA-GNPs的成功修饰。从图6可看出，GNPs的紫外可见吸收光谱521 nm（GNPs）红移到了524 nm（TCs Ag-BSA-GNPs）处，这种红移现象说明GNPs已成功偶联上了TCs Ag-BSA，在红移的过程中没有明显的峰展宽，说明GNPs不仅没有聚集现象而且具有良好的分散性[35]，同时，偶联TCs Ag-BSA后的GNPs所产生的红外吸收光谱红移后有利于提高FRET体系的灵敏度[40]。还可以看出，当UCNPs和GNPs结合后，能够发生能量共振转移，使得GNPs的吸收光谱和UCNPs的荧光发射光谱具有重叠的光谱，从而导致荧光淬灭。

图6 GNPs、TCs Ag-BSA-GNPs的紫外可见吸收光谱和TCs Ab-UCNPs的荧光发射光谱Fig.6 UV-vis absorption spectrum of GNPs,TCs Ag-BSA-GNPs and UC fluorescence emission spectrum of TCs Ab-UCNPs

2.3 基于FRET体系检测TCs的结果

在FRET体系中，固定供体和受体的浓度，改变游离TCs Ag-BSA的浓度，976 nm的红外光激发下检测溶液中荧光强度变化，如图7所示。图8为不同浓度的TCs Ag-BSA在不同体系下的荧光强度关系，图9为不同含量的TCs抗原和荧光恢复量（I-I0）的线性关系。

图7 不同浓度的TCs抗原在FRET体系中的荧光光谱Fig.7 The UC fluorescence spectra image of the FRET system at different concentrations of TCs Ag-BSA

图8 不同浓度的TCs抗原在不同体系下的荧光光谱图Fig.8 The fluorescence spectra between the different concentration of TCs Ag-BSA and the fluorescent intensity in different system

随着抗原浓度的增加，UCNPs和GNPs之间的距离缩短，能量从供体不断转移至受体，使得UCNPs的荧光强度逐渐增加。图8中I-I0代表荧光淬灭-恢复量（I：加入不同浓度TCs Ag-BSA后的UCNPs-GNPs体系荧光；I0：没有加TCs Ag-BSA的UCNPs-GNPs体系荧光），随着TCs Ag-BSA浓度的增加，体系中的荧光恢复量逐渐增加，直到250 ng/mL荧光强度开始趋于平稳。在0.1 ng/mL～250 ng/mL范围内，荧光强度逐渐增加，在30 ng/mL～100 ng/mL范围内，抗原浓度与UCNPs的荧光强度呈现出了良好的线性关系，相关系数为0.995 67（如图9所示）。当TCs Ag-BSA的浓度超过250 ng/mL，FRET体系的荧光强度趋向于平稳，最低的检测限为0.1 ng/mL，UCNPs和GNPs所产生的荧光淬灭量基本得到恢复。

文章来源：《无损检测》 网址: http://www.wsjczzs.cn/qikandaodu/2021/0625/568.html