基于荧光共振能量转移快速检测食品中的四环素(2)

1.3 方法

1.3.1 上转换发光材料（NaYF4：Yb，Er UCNPs）的合成

采用水热合成法[33-34]进行制备：称取适量的稀土氧化物氧化钇、氧化镱和氧化铒，加入过量的HNO3溶液使其完全溶解，通过加热蒸发以去除多余的HNO3溶液，最后加入去离子水，混匀后即可得到稀土硝酸溶液。然后分别取2.5 mL硝酸钇、1.5 mL硝酸镱和1.2 mL硝酸铒溶液，混合均匀后缓慢加入2 mL 0.5mol/L的柠檬酸钠溶液，超声振荡30 min，然后在混合溶液中缓慢滴加适量的25 mL 1 mol/L NaF溶液，待溶液出现肉眼可见的白色沉淀物后，用NaOH调节溶液的pH值（pH5），磁力搅拌下反应1 h。然后将混合溶液转移到聚四氟乙烯瓶中，密封，并在180℃下保持4 h。待冷却至37℃后，通过离心分离沉淀物，依次用乙醇和去离子水洗涤（至少洗涤3次），最后将洗涤好的沉淀物放入60℃的烘箱中干燥24 h，即可获得上转换发光材料（NaYF4：Yb，Er UCNPs），研磨成粉末备用。

1.3.2 NaYF4：Yb，Er UCNPs的表面修饰

采用改良的St?ber法对其进行修饰[35-36]，利用超声将制备好的 40 mg NaYF4：Yb，Er UCNPs 粉末分散于60 mL正丙醇溶液中，搅拌均匀后将混合溶液放入恒温水浴锅中35℃下搅拌40 min，然后分别加入2.5 mL 25%的氨水和20 mL纯水，反应1 h。然后加入正硅酸乙酯和正丙醇溶液的混合溶液（即取25 μL正硅酸乙酯并用20 mL的正丙醇溶液将其溶解），反应4 h。再将0.2 mL APTES溶于30 mL正丙醇溶液中，并将其加入到上述混合溶液中，反应1 h。然后将反应后的溶液转移至离心管中离心，离心后弃上清，得到的沉淀物用乙醇和蒸馏水洗涤3次。最后将其放入60℃烘箱中烘干12 h，即可获得氨基化的上转换纳米粒子NaYF4：Yb，Er UCNPs。

1.3.3 氨基化NaYF4：Yb，Er UCNPs连接四环素类抗体（TCs Ab）

取制备好的氨基化NaYF4：Yb，Er UCNPs粉末20 mg，加入5 mL的PBS使其完全溶解，然后加入1.25 mL 25%戊二醛溶液和100 mg NaBH4，混合后在37℃下反应1 h。反应结束后，将得到的产物进行离心，弃上清液，得到的沉淀用PBS重复洗涤3次，将洗涤好的沉淀物再次超声分散在PBS中，然后取25 μL TCs Ab和100mgNaBH4加入到上述溶液中，37℃摇床反应1h。然后，加入100 mg Tris作为封闭剂，继续反应1 h。反应结束后通过离心得到沉淀物，用PBS洗涤沉淀3次后去掉上清液并用1 mL PBS收集沉淀，得到的TCs Ab-NaYF4：Yb，Er UCNPs于4℃下保存备用。

1.3.4 金纳米颗粒（gold nanoparticles，GNPs）制备及偶联四环素类抗原

采用柠檬酸还原法[37-38]稍作修饰制备GNPs，先用0.021 6 g HAuCl4和240 mL去离子水混合以制备HAuCl4水溶液，然后将溶液转移到三颈圆底烧瓶中，使其加热至100℃，保持10 min。称取0.125 g柠檬酸钠，加入12.5 mL去离子水溶解，将二者的混合溶液加入到上述圆底烧瓶溶液中，溶液颜色由浅黄色变成酒红色后，保持反应30 min，反应结束后，自然冷却到37℃左右加入1 mL去离子水和0.004 2 g PVP的混合溶液，搅拌过夜，得到的GNPs溶液于4℃保存备用。

取上述制备好的GNPs 10 mL，用PBS将溶液的pH值调至8，然后向溶液中加入20 μL TCs Ag-BSA，冰浴中搅拌1 h。接着加入50 mg BSA作为封闭剂，继续搅拌1 h。反应后将溶液转移到离心管中在10 000 r/min下离心10 min，得到沉淀用0.01 mol/L PBS洗涤3次，弃上清液，最后分散在10 mL 0.01 mol/L PBS中，得到GNPs偶联TCsAg-BSA的溶液，即TCsAg-BSA-GNPs。

1.3.5 FRET体系的构建

将 100 μL 25 μg/mL TCs Ab-NaYF4：Yb，Er UCNPs悬浮液添加到一系列含有TCs Ag-BSA溶液的小试管中，反应0.5 h后取适量20 μg/mL TCs Ag-BSA-GNPs溶液添加到各小试管中，然后加入PBS溶液定容至1 mL，37℃摇床反应40 min，反应后用光谱仪进行荧光测定。

1.3.6 基于FRET体系检测牛奶中TCs

取若干个1.5 mL的小试管，加入适量牛奶溶液，然后将相同浓度的BSA、TCs Ag-BSA、DO、TC加入到牛奶溶液中，混合均匀。然后取100 μL 25 μg/mL的TCs Ab-NaYF4：Yb，Er UCNPs加入到上述溶液中，反应0.5 h后加入20 μg/mL TCs Ag-BSA-GNPs溶液适量，接着加入PBS溶液定容，使混合物终浓度为20 ng/mL，置于摇床上37℃反应40 min后，进行荧光测定。

2 结果与讨论

2.1 NaYF4：Yb，Er UCNPs和 GNPs的合成表征

图1～图4为NaYF4：Yb，Er UCNPs和 GNPs的合成表征。

图1 NaYF4：Yb，Er UCNPs的形貌表征图Fig.1 The appearance characterization image of NaYF4：Yb，Er UCNPs

图2 GNPs的大小和形态表征图Fig.2 The size and morphology characterization image of GNPs

图3 NaYF4：Yb，Er UCNPs的晶型结构表征和标准卡片对比Fig.3 The crystal structure characterization of NaYF4：Yb，Er UCNPs，compared with standard cards

文章来源：《无损检测》 网址: http://www.wsjczzs.cn/qikandaodu/2021/0625/568.html